引 言
栽培大麦是人类所共知的最古老谷类之一，其产量居世界谷类作物产量的第四位，目前世界上仍有10亿多人口以大麦为主食。近年来以大麦为材料的研究正在不断深入，将生物工程技术引入大麦育种的研究也日益受到重视。大麦已经由传统地作为动物的饲料而转变成为在人类的食物和啤酒生产中起到了越来越重要的作用，由此，对大麦的产量和品质要求也不断提高。组织培养技术和基因转移技术是生物工程技术中的主要技术，是植物育种学家补充的工具，并且在改良这个具重要经济意义农作物中具有着巨大的潜力和应用前景。
组织培养
从大麦花药、花粉，子房、胚乳，未成熟胚和体细胞胚胎进行大麦的植株再生是研究者们有效的生物技术之一。但是，需要做更多'的研究工作才能够从原生质体中再生出植株。基因型和培养基对大麦愈伤组织的诱导及植株再生具有巨大的影响，通过培养不同幼苗外植体和利用未成熟胚，很容易诱导出愈伤组织；通过把易碎的愈伤组织接种在液体培养基中就可以起动细胞悬浮培养物，然后把分散性好的细胞悬浮物接种在含有细胞分裂素和生长素的固化培养基上，即可进行器官和体细胞胎的发生。愈伤组织和细胞悬浮培养物的局限性就是它们的染色体变异和要对它们通过频繁的继代培养来进行保持。大麦的组织培养已经广泛地用来进行以下几方面的工作：单倍性诱导；体细胞胚胎发生；原生质体的分离。
一、单倍性诱导
单倍体可应用于诱导突变和快速生产大量的、遗传上的纯合品系。在大麦中，首次由约翰逊（Johansen）发现了自然单倍体的植株。古哈（Guha）和曼合希瓦利（Maheshwari）首次报道了通过培养曼陀罗花药而诱导其单倍体，自从那时以来，用花药培养进行其它种的单倍体诱导，报道陆续不断。另外，通过花粉的胚胎发生的直接植株再生方式将减少质体突变和嵌合现象。
染色体消除法
1. 大麦和球茎大麦的种间杂交
人们对种间杂交染色体消除的机制还不了解，但是可以肯定球茎大麦染色体的消除是由大麦的2号和3号染色体遗传控制的。染色体消除在穗状花序原基中所发生的速率比在其杂种的根分生组织中发生的速率高，这暗示染色体消除现象是组织依赖现象。
细胞学观察也表明起源于穗状花序原基的愈伤组织细胞染色体数目是增加的，但是细胞周期时间并不与染色体消除相关，其原因在于有丝分裂时影响纺锤体功能或形成的遗传调节异常，导致了杂种细胞蛋白质代谢的异常，结果导致了染色体的消除。纺锤丝与着丝粒间的异常作用导致了在大麦和球茎大麦之间所形成的杂种染色体消除，故在高生理活性的组织中尤其像胚、胚乳和穗状花序原基这样的分化细胞中，都有高频率的染色体消除发生；生理活性低下的愈伤组织染色体消除速率降低。在其它大麦属、种间杂交中，也观察到了导致单倍体生产的染色体消除现象。
2. 属间杂交的利用
已从属间杂交中得到单倍体再生恢复。随着染色体加倍技术的发展，利用单倍体而来增强育种品系的发育将成为可能。来源于小麦和球茎大麦间属间杂交的单倍体小麦以及来源于大麦同新麦草之间杂交的单倍体大麦都已经产生了，研究者们已发现小麦的杂交能力是受到位于5B和5A染色体上基因的遗传控制的，也受到了所培养的未成熟胚的年龄影响。
应用胚解救技术也已经获得了属间杂种，但利用此技术所持到的属间杂种频率却相当低。人们已在小麦属、大麦属及黑麦属之间获得了有活力的杂种。这些属间杂种都是自交不可育的，并且在小麦属与大麦属之间或黑麦属与大麦属之间很少产生能育的双倍体。
通过应用胚解救技术使六倍体小麦与二倍体大麦之间产生的属间杂种得到了再生 · 后来，纳卡缪拉（Nakamura）又从通过培养此六倍体小麦与大麦所产生的属间杂种花序组织所获得到的全能性愈伤组织中得到了再生的植株。其体细胞染色体数目为28，但是其六倍体小麦再生植株只有35条染色体，而不是原来认为的42条。该种类型染色体不稳定性在小麦属和大麦属中的品种，以及在六倍体小麦和大麦杂种所形成的体细胞无性系中都有过报道。
花药培养
在禾本科中，通过花药培养所进行的单倍体诱导的成功率还没有像茄科植物中那样大，但已经在水稻、小黑麦、小麦、玉米、山羊草和黑麦中再生了单倍体植物。克拉法姆（Clapham）从大麦花粉中诱导了绿色的植株和白化的植株，所得到的绿色植株有单倍体、二倍体和四倍体。一般说来，来源于花药培养的单倍体大麦再生植株其分化能力是低下的，影响雄核发育的因素有：基因型、花粉的发育状态、花药密度、液体培养基加入的葡聚糖、生长激素和花药的前处理。花药的低温处理可增加大麦和水稻花粉愈伤组织形成的频率。
大麦花药在培养基中放置方向对愈伤组织形成的诱导和胚状体发生有显著的影响。在正常情况下，当大麦花药的裂片朝上，胚状体就得以产生，而当裂片处接触培养基时，就不产生胚状体。
人们已经很好地了解了在稳定和诱导成熟花粉的萌发中，蔗糖所具有的影响，高蔗糖浓度仅对胚胎发生的诱导是必须的，但对后续的胚发育却不是必要的。高蔗糖对大麦花药培养是必须的，当蔗糖高到9 ~ 12%引起大麦花药培养的雄核发育的诱导，并且也可能导致了白化现象。白化的植株不仅常在其它的谷类植物中发生，也常常在所培养的大麦花药中发生。
子房或胚珠培养
运用子房培养进行单倍体的诱导只有少数的报道。已经从大麦、水稻、小麦和玉米的胚珠中产生了单倍体。
分离的小孢子培养
—般情况下，单倍体植株通过花药培养进行再生是通过雄核发育途径。该种方法也有某些局限性。因为花药壁可能抑制雄核发生的胚状体和愈伤组织的诱导作用，而通过培养基、植株生长条件改变以及通过使用分离的小孢子在液体培养基中培养而得到克服。
人们已经设想培养花粉粒以诱导黑麦、大麦、水稻和小麦等谷类植物的单倍体。培养的花粉可以诱导出愈伤组织，但是却不能进行再生植株。然而，通过直接培养分离的大麦花粉粒已经使植株得到了再生。通过改良预培养和培养方法可增加通过培养花粉粒所诱导的愈伤组织效率。
二、体细胞胚胎发生
由大麦组织培养通过器官发生途径或通过体细胞胚胎发生途径都可获得大麦植株再生，在其它谷类植物中也已经有体细胞胚胎发生和植株再生的报道。诺斯托格（Norstog）使培养的，切离的，未成熟大麦胚再生出像胚样的结构物，并且通过体细胞胚胎发生途径使其再生出植株。已经表明体细胞胚胎发生能够从大麦的顶端分生组织和成熟胚中得到诱导。
体细胞胚状体可以用来进行人工种子生产和低温保存。由于这些胚状体来源于单细胞，因而所再生的植株都是均一的，并具有较少的染色体变异。
三、原生质体的分离和再生
尽管已经从大麦原生质体中获得了愈伤组织，但是还没有证据表明从其原生质体中有植株的再生。近来已有报道从水稻、甘蔗和珍珠谷原生质体中都已经成功地进行了植株的再生。
尽管从许多谷类原生质体中再生出完整的植株仍然有困难，但是能够从小麦、小黑麦和大麦原生质体培养中诱导出愈伤组织。从玉米原生质体中能形成愈伤组织及体细胞胚状体和从水稻原生质体中能够再生出植株的事实表明谷类植物的原生质体是具有全能性的。
大麦的原生质体可以应用于除草剂抗性的转移，采用原生质体变异、电穿孔，DNA显微注射、根癌农杆菌的转化、属间的基因转移，细胞器摄取、通过细胞融合细胞质雄性不育性的转移以及突变等办法。最近，通过用高山矮牵牛的染色体进行显微注射已经使矮牵牛原生质体得到了遗传转化。然而，利用原生质体也有两个局限性：第一、需要有可靠的植株再生系统，第二、可能发生染色体的变异。
大麦的基因转移技术
利用土壤细菌根癌农杆菌和生根农杆菌已经很好地进行了茄科植物的基因转移技术。这些细菌极难感染单子叶植物，因而在谷类作物中是难于应用遗传工程技术，过去，从体外培养和遗传操作，谷类作物都是很难的，然而，由于在水稻原生质体和其它几个禾本科植物种的植株再生的最新进展，现在已可能实现其它谷类植物的基因转移技术。到现在为止，仅有少量分离的基因可用于谷类植物的育种计划中去，所以，在植物育种学家、生理学家、病理学家、分子生物学家和细胞生物学家之间需要有更多的合作以便能够：（1）定义所研究的有意义的基因；（2）分离并修饰这些基因并且重新把它们引入到这些受体植物中去；（3）谷类农作物以及其它的经济植物通过遗传工程进行再育种。
一、基因转移的方法
1. 电穿孔
高电场强度的电刺激可以使生物膜两面具渗透性，电刺激有两个重要的应用方面：第一，就是把外源DNA导入到动物细胞内；第二，就是细胞融合的诱导。佛罗姆（Fromm）发展了一种把外源DNA导入到植物细胞中去的电穿孔方法，其基因转移的效率随外源BNA浓度而增加，并且受到电流强度、电脉冲持续时间和单子叶及双子叶植物所使用的培养基的影响。史利托（Shillito）利用高电压电脉冲、聚乙二醇以及热休克处理提高了把基因直接转移到烟草原生质体中的效率。近来，在玉米、烟草、水稻、小麦、高粱和胡萝卜中都使它们稳定的转化得到了恢复。电穿孔已经用来获得最佳的基因转移效率和暂时的基因表达研究。通过此方法，并同应用显微注射方法相比较，把外源DNA转移到植物原生质体中，不仅是相对和简单而且也是比较有效的方法，因而，电穿孔方法并不像显微注射方法那么费力的。
电穿孔方法尽管转化频率是高的，但是由于电脉冲导致的在质膜上的穿孔可能会促使细胞内大分子及代谢物的丧失。
2. 电注射
电注射已经用来转化酵母细胞和把烟草花叶病毒RNA直接引入烟草叶肉细胞中去。电穿孔与电注射之间主要的区别在于电穿孔是用来进行外源DNA或RNA向原生质体中的引入，而电注射进行此引入工作时，是利用了完整的细胞，而并不需要将细胞壁除去。
对大麦来说，用胚性的和非胚性的细胞悬浮物中再生出植株是可能的。电注射适合于把外源DNA引入到能够被诱导进行体细胞胚胎发生进而再生出具有较少变异的植株。如果大麦细胞的通透性不能足够用来进行电注射，可以在电脉冲之前利用纤维素酶对其细胞壁进行部分地消化。然而，也可能从细胞膜穿孔处，有代谢物及核酸物质的漏出。
3. 多细胞结构的DNA显微注射
缺乏从原生质体中植株再生的成功限制了大麦的遗传转化。但是，在大麦及其它谷类作物中植株却容易通过体细胞胚胎发生途径及器官发生途径而得到再生，因此，应该开发建立大麦遗传转化可以选择利用的，并不依赖于原生质体的那些方法（把BNA显微注射到可形态发生的愈伤组织、体细胞胚、未受精的和受精的卵细胞及合子胚中去）。若能够把分离的DNA直接显微注射到未成熟的大麦胚内并且从所筛选的已转化的愈伤组织中诱导其体细胞胚胎发生，那么最终会导致较少变异的植株再生。
研究者们已经把编码卡那霉素抗性的质粒DNA注射到正在发育的黑麦花序内，并且已经得到了抗卡那霉素的植株，与此相似的情况还有，通过把萌发的拟南芥菜种子同根癌农杆菌进行共培养已经使得抗卡那霉素的植株得到了恢复。
4. 花粉和子房的转化
在正常的植物受精中，接触于受体开花植物柱头上的花粉产生一个穿过柱头和花柱并且最终达到珠孔道的花粉管。此花粉管进入珠孔道内并释放出两个雄性的核，该两雄核中之一同卵细胞核融合并形成了一个合子，而另外的一个雄核同两个极核相融合从而形成了初级胚乳。此合子和初级胚乳重复地分裂结果依次地形成了胚和胚乳。此雄细胞和雌细胞在它们细胞融合时并没有细胞壁，并且此过程的融合相似于两个原生质体的融合。如果含有选择标记物及所克隆基因的外源DNA直接注射到子房中去，此DNA就可能被卵细胞所吸收并且也可能被极细胞所吸收，因此，可以在胚和胚乳中对所引入的基因的表达进行检验，已经从未传粉的大麦子房中再生出单倍体植株，并从通过培养未成熟的大麦胚乳所获得的诱导愈伤组织中也再生出了单倍体的植株。卡普曼（Chapman）认为外源DNA可以直接应用于花粉，以之作为一个可能的，进行定向遗传变化的策略。刚萌发出的花粉管在短暂的时间内是缺乏壁的，此时的管壁就能够容易吸收DNA到管子中。在玉米中，通过受体植物与该供体DNA—同进行受粉，已经获得了高的遗传转化率。
5. 圆球体的应用
在谷类的单子叶植物中，由于缺乏防止冠瘿瘤在单子叶植物中形成的根癌农杆菌属附着位点，一直难于利用根癌农杆菌进行转移基因，这也可能是由于单子叶植物对根癌农杆菌属感染所诱导的，增加的植物激素不具有敏感性的原故。然而，没有瘤的Ti质粒基因的表达在单子叶植物中已经有了报道。在谷类植物细胞中，为了避开依赖根癌农杆菌属感染过程进行的转化，必须要建立发展其它的方法。
大筋杆菌圆球体已经成功地用来在酵母及哺乳动物细胞中进行基因转移。通过圆球体的植物原生质体转化过程正是由于内吞作用的缘故。较早期的禾本科植物，小麦属和黑麦草属植物原生质体的转化是通过聚乙二醇处理，利用裸露的DNA吸收到原生质体内而获得成功的。水稻原生质体的转化最近是通过根癌农杆菌圆球体所介导的。
6. 脂质体的应用
脂质体已经用来作为一种运输工具把具有生物活性的分子转移到动物细胞中去及植物原生质体中去，由原生质体吸收含DNA的脂质体的机制可能是由于含DNA的脂质体吸附到原生质体的表面或者是由于脂质体与此质膜之间的融合的缘故。与此相反，在聚乙二醇存在的条件下，脂质体进入植物原生质体是通过内吞作用，当内吞的脂质体同核内膜融合时，脂质体就释放出此核酸物质。当质粒DNA通过脂质体被转移到胡萝卜原生质体时，在DNA吸收的过程中已经发现了变异，质粒DNA分子的逐渐消失，表明在长期的细胞培养中质粒DNA的不稳定性。然而绝大多数的供体DNA都与核酸和染色质相结合着。
二、转化体的筛选
为检测所引入到转化的细胞和植物中基因的表达，有一个良好的筛选标记是必须的。具有一定DNA顺序的根癌农杆菌已经用来把基因向许多双子叶植物的基因组中转移。几位研究者已经利用了带有编码细菌抗菌素的抗性基因并结合着胭脂碱合成酶的启动子序列的嵌合基因，并且已经表明这些嵌合基因在植物细胞中进行了表达。这些可以筛选的主要的细菌抗菌素抗性基因，已经在双子叶植物中得到了利用，这些抗性基因具有对几种抗菌素：新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）——分解卡那霉素（即新霉素和G418）；二氢叶酸还原酶（DHFR）——可分解氨甲蝶岭；氯霉素乙酰转酰基酶（CAT）——分解氯霉素的抗性。此方法已经在玉米、黑麦、小麦、水稻和大麦中得到了应用，另一个编码CAT基因也在水稻、小麦、高粱和玉米中得到了利用。一个新的选择标记，争光霉素已经通过利用根癌农杆菌在蓝雪叶烟草中进行了试验，此抗菌素，争光霉素是一个与DNA相互作用并导致单链和双链断裂的糖肽。在人类癌症治疗中，此抗菌素用来作为细胞毒素药剂。植物细胞对争光霉素是敏感的。
来源于萤火虫的荧光素酶（Luciferase）基因已经常规地用来作为在转移的植物细胞和转基因植物中，光产生而引起的基因表达的标记，并且此荧光素酶基因要比标准的CAT分析测量方法敏感100倍。最近，又发展了一个“标志”酶并且已经对它进行了检测，此酶是由大肠杆菌B－葡糖苷酸酶基因（Gus）所表达的产物。
[Current Science，1988年57（2）]