植物组织受到病原体感染后，激起一系列的生物和分子感应，这些感应在与疾病或抗病有关的可见症状中达到高峰。在有关感应中，反应的特性以及反应的时间和空间上的协作在植物和病原体中都起决定性的作用。这种微妙的平衡进程也经常受到显著的进化上的调节，环境的影响和生理上的调整。因此，如果要理解并弄清这些寄主—病原体之间感应的分子方面的复杂情况，就要详尽地观察在时间和空间方面的感应进程以及一些特殊器官在进化、环境和生理上的状态。

越来越明显的事实表明：决定寄主的抗病性或易感性经常是发生在有限的几个细胞中，或者说，只发生在最前线的受感染的细胞以及一些即将受感染的细胞中，即病原体和寄主直接接触的一个非常狭小的区带。感染达到组织后所发生的感应基本上与初期的感染无关。因此，靠简单的组织分析来衡量反应是不够的，即使是在那些代表不同病害的典型病例中也是不够的。因为这些典型病害可能代表了许多细胞和分子反应的组合。

这种在细胞水平上测量分子反应的需要，导致了细胞生化方面的一些有用工具的发现，这些工具可以直接应用于整个完整的组织。我们的目的并不在于叙述细胞研究中感应作用所有方面的情况，而是通过精选论文的讨论，阐明在植物中寄主－病原体感应作用的一些新概念以及有关空间定位和进程的方法学。

三个主要的抗病反应将分别描述：第一，寄主抗体的积累和细胞壁的次生代谢；第二，病原体细胞壁的降解以及水解酶（几丁酶和β-1.3－葡萄糖激酶）的积累；第三，寄主细胞壁蛋白的积累，即富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGPs）的积累。由此可见，这三种抗病功能的中心问题在细胞水平上是不同的，这就要求我们对细胞研究的不同方面进行探讨。

次生产物的抗病机制

次生产物在植物抗病中起着多种作用，其中包括产生相克物质，如抗菌素（植物防御素）或共价键，和能加强细胞抗菌作用的细胞壁酚。

要从整体上了解次生产物在细胞水平上的抗病作用、必须全面评估在翻译和转录水平上以及在酶活力和产物积累水平上的基因表达的时间和空间的情况，下面我们将会讨论到，在确定的寄主－病原体系统中，细胞学的方法如何用于反应的各种水平的某些测量。虽然与抗原有关的次生产物可以通过各种代谢途径得到，但我们主要讨论苯丙酸途径，因为它具有普遍性，并且目前研究得也较多。

苯丙酸代谢所需酶的mRNA的细胞定位 当寄主受到损伤，引发或感染时，能检测到苯丙酸代表以及其支路酶的mRNA。目前，我们已经掌握了两种重要的方法：由原位杂交引起的特殊的mBNA的分析以及转基因植株中启动子－通讯基因融合的分析。这两种方法远远超过直接跟踪抗病基因的激活作用的方法。因此，它们是检测寄主－病原体感应中特殊的分子遗传学的强有力的技术。有鉴于原位杂交能为自然发生的转录观察直接提供便利，运用通讯基因可以检查特殊基因在表达时的精确限定的调节顺序。这种技术的不足之处在于它不能提供有关的抗病蛋白或代谢产物随着基因激活而真实积累的图像，并且，用这种方法不能观察到蛋白质的翻译、转变、活力以及代谢水平上重要的调节情况，同时，这种方法只能适用于已经分离的基因或者基因探针已经存在的情况。

哈尔伯洛克（Hahlbrock）及他的合作者对马铃薯和欧芹进行了精细的研究，表明了原位杂交方法的有效性。用感染性恶疫霉Phytophthora infestans感染易感的和抗病的马铃薯的栽培品种，在两者的幼叶组织中都能检测到苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的mRNA的原位杂交定位。在不相容的感应中，虽然超敏反应进行得很快，但是它严格地按照从表皮到叶的其它部分的顺序进行。虽然，在3小时内就可以观察到超敏细胞的死亡，此时，PAL mRNA在细胞中已停止积累。但是在与超敏损伤直接相邻的细胞中（一个极其狭小的区域），PAL mRNA在3小时内的水平还是很高，直到6小时，才开始下降到对照的水平。真菌的免疫组织化学定位表明：早期的PAL激活作用实际上是要超过真菌菌丝的生长而传递信号。相反地，在易感感应中，PAL的活动将推迟，而且更加分散而缓慢。

对欧芹进行类似的实验是：用7种公认与抗病有关基因的反感应探针感染欧芹的叶子，引起的非寄主超敏反应与马铃薯的大致相同。在与坏死部分直接相邻的狭小细胞区中，七种抗病基因都能暂时得到诱导。但是，不同转录本的诱导在时间上有差别。PAL，4－香豆素：CoA连接酶以及一种与发病机理有关的蛋白和3种其它抗病有关基因（ELI 3，5和7）都能很快地被诱导，然而，呋喃香豆素专一性酶和香柠檬邻甲基转移酶的基因要几个小时后才能被诱导。作者从这些研究中可以断定：超敏细胞本身的死亡过于迅速以致没有抗病基因的激活作用，表明反应细胞的狭小区域可能是信号传递的过渡区。他们还断言：呋喃香豆素一类的植物防御素不存在于最早的抗病反应中，而反应细胞的酯化细胞壁酚的积累发生得较早。

通讯基因的融合与mRNA原位杂交的结果是如此相似，这表明在不相容反应中，主要基因的激活反应局限在超敏病原菌感染点周围的一个很狭小的细胞圈内。有限的基因激活作用有可能发生在离伤害处更远的细胞内。

对于在原位杂交中与这些基因相关的蛋白质的积累，研究得不多。下面讨论的蛋白质抗病反应，应该推广应用，这也是对研究mRNA工作的一种补充。

结论——次生产物的抗病反应 次生产物抗病的研究强调了不同方法的相互补充。迄今为止，次生产物抗病的研究成果如下：对于病原体超敏性伤害的抑制同时发生在因超敏而死亡的细胞和它们周围的活细胞中。这两个区域是截然分开呢还是同样的细胞，只不过是反应时间的不同而导致表观上不同的两个区带，反应时间的长短由不同的寄主－病原体感应而定？有一点是共同的，即局部反应首先导致基因的激活，为早期的苯丙酸代谢和类黄酮代谢作准备（如PAL，CHS），后来的基因激活为植物防御素的积累作准备。在代谢水平上，这些感应首先导致壁缘酚的沉积，接着是双黄酮的水解以及植物防御素的积累。

上述的两个区带的区域反应和远域细胞反应是各自独立的信号反应事件呢，还是简单地反映了受中心诱导反应刺激后的基因活动的程序表达？这是一个非常有趣的问题。

水解酶

在植物的各种各样的抗病相关的蛋白中，水解酶——几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶的积累，是研究得最广泛的一个课题。这两种水解酶被认为是真正的与发病有关的蛋白（即PR蛋白），具有与其它PR蛋白类似的特征，如低分子量，抗蛋白酶的水解，从低pH中提取，出现在受感染组织的非原生质体中。几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶在植物抗病中起着多种作用。首先，它们能释放病原体的细胞壁碎片，这些碎片是刺激寄主抗病反应的诱导物；其次，它们能降解病原体的细胞壁，破坏新细胞壁物质的沉积，致使病原体死亡。在后一作用中，在病原体新细胞壁沉积的位点——菌丝的顶部，几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶相互合作，进行溶胞作用。在这两种作用中，这些酶的非原生质体的定位显得很重要。因此，这种酶的作用效果集中在反应的亚细胞定位和酶之间的时空协作上。

几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶在受感染组织中的非原生质体的定位首先是从细胞间隙液体的研究中得到的。这两种酶在抗病组织中的积累比在易感组织中快得多，这也说明了它们参与抗病作用。

为了解决被感染组织本身固有的问题，梅切和斯塔黑林（Mauch & Staehelin）（1989）用乙烯诱导青豆叶组织中的几丁酶和葡萄糖激酶，用免疫化学和生化分馏的手段对酶的亚细胞分布进行了更详尽的研究。结果表明，乙烯诱导的酶几乎是液泡中独一无二的酶（100%的几丁酶和大于95%的β－葡萄糖激酶）。这些结果导致梅切和斯塔黑林提出一个普遍的模型，根据这个模型，水解酶只有在细胞死后才能进入非原生质体中，同时伴随着超敏反应。

虽然这是一个很有趣的模型，并可以用来解释寄主与病原体的感应作用，但另一些研究强烈表明：这些酶的分布规律很复杂，不能简单地归结为是细胞解体的结果，比如，在烟草中，β-1，3－葡萄糖激酶的酸性和碱性同分异构形式同时存在，并由不同的基因编码。这两种基本的同分异构体位于中心液泡中。用水杨酸处理或用管状假单胞菌感染将导致另外3种酸性同分异构体的非原生质体的积累。液泡中的同分异构体不会随着感染渗透到细胞外的空间中。因此，至少在这个系统中，受激素（碱性的细胞内的同分异构休）调节的基因与受感染（酸性的细胞外的同分异构体）调节的基因不同。

更精细的研究支持了β－葡萄糖激酶在被感染组织的非原生质体中积累的观点。本哈蒙（Benhamon）等比较了感染植物的真菌菌丝的精确位点和β－葡萄糖激酶的积累位置。结果发现，在感应中，真菌菌丝遍布几个组织，经120小时，最后到达维管柱。运用免疫金技术，发现β－葡萄糖激酶的积累发生在所有直接接触到真菌的寄主细胞的细胞壁中。不相容感染是严格地局限在根部的最外层组织中，然而，在感染的最前线的健康细胞的细胞壁上也发现大量的β－葡萄糖激酶的沉积。因此，这种酶在细胞壁上的沉积是一种特殊现象，不是由组织解休引起的。

分析用感染性恶疲霉｛Phytophthora infestans）感染过的马铃薯叶的转录基因的活动，所得的结果与苯丙酸代谢酶的基因的近域激活作用相反：几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶的表达在整张叶子中更慢，更有秩序。在抗病或易感感应中，这些水解酶的总活力没有什么区别。

总结 一般地说，水解酶的积累相对来说出现得比较晚。虽然这与抗病反应中病原体的衰弱以及最终达到抑制相一致，但是，如果认为水解酶使病原体的第一个诱导物得到释放，似乎太晚了一点。有可能低水平的同功酶会出现在非原生质体中，诱导物的释放可能就是依靠这些同功酶完成的。被释放的诱导信息将以各种各样的防御机制为靶，其中包括胞外的葡萄糖激酶和几丁酶，这些酶是产生更高水平的诱导物所必需的。这种信号放大机制使我们回想起病原体真菌中的几丁酶基因的诱导。

跟次生代谢类似，在近域和远域细胞反应中都有几丁酶和β-1，3－葡萄糖激酶的积累。最新的研究表明，葡萄糖激酶在空间上出现在几丁酶之前。葡萄糖激酶的远域诱导是怎样特异地同CHS双黄酮和过氧化物酶的远域诱导相联系，是一个很诱人的问题。

富含羟脯氨酸的糖蛋白

在植物中，不同类型的富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGPs）的区别在于氨基酸顺序的细微差别以及糖基化的形式不同。HRGPs与寄主抗病有关的是1）不溶性的伸展蛋白，被认为是在细胞壁加固中的一种基本的结构物质；2）可溶性的伸展蛋白和乳状的HRGPs具有粘性，可能与病原体的识别及固定有关。

因为HRGPs稳固地定位在细胞壁上，所以，对它们的研究主要集中在HRGPs与细胞壁的物理联系上。青豆下胚轴与真菌不相容感染的特征是早期（少于4天）大量的HRGP转录本在表皮、皮层、维管束组织中积累，这些组织都直接与接种位点相邻。因为真菌不能穿透表皮层，这些结果说明近域细胞抝远域细胞都有反应。相容反应与此有显著差别。到第7天时，克隆已经穿透表皮层并遍布皮层，但在表皮和皮层细胞中没有HRGP转录本的积累，只是在接种的7天以后，才看到维管束鞘组织中有转录本积累。

奥康纳尔（O′Connell）等在1990年研究了西瓜和青豆在接种到几种病原体中以后的伸展蛋白的免疫细胞化学定位。荧光假单胞菌（寄生菌）在两种寄主的叶中都没有可见症状，但在6小时的接种过程中，伸展蛋白的抗体涌向壁缘区域，形成无定形物质，这些物质可以形成鞘状以包埋细菌。作者由此假定：成鞘物质中出现HRGPs是因为这些糖蛋白能把细菌粘着并固定在植物细胞的细胞壁上。

结 论

寄主－病原体感应作用在细胞生化领域取得令人兴奋的进展。越来越多的事实证明：植物能很灵活地使它们的抗病反应相互协调。虽然类似的抗病基因在一些植物中已经得到诱导，但通常这些特殊的基因及其诱导产物具有物种特异性，甚至是器官特异性。各种各样的防御基因的诱导在某一种植物中，还受到复杂的时空控制，并与入侵的病原体的种类有关。

很显然，在寄主的不同细胞群中有不同的抗病反应。虽然一些反应看起来是发生在感染的最前线，另一些反应好像是受到前线反应的影响而产生的，但是，联系这两种反应的关键，在于诱导物的产生和接受，尽管近域反应和远域反应都是由诱导物的处理引起，我们还研究在不同反应细胞中能引起反应的信息的特性，信息的接受和信息的转导。在被感染的组织中，纯化的诱导物同近域和远域事件有确定的关系，它将给细胞研究带来很大的便利。

在植物抗病中，有关的被公认的抗病机制大部分是相互联系的。随着我们的理解和方法论的提高，这些联系越发显得有意义。技术的相互补充，仪器的改进以及新的原位杂交方法的发展，加倍地便利于将来的研究，并且促使平行的实验系统更加完美一致。

[ Cellular Coordination of Molecular Responses in Plant Defense Molecular Plant-microbe Interactions 1991年第4卷第5期］