传统的正向遗传学主要用于克隆表型或功能已确定的基因。转座子标签突变体可用随机标签法从带有活性转座子的自交后代中筛选得到，或用定向标签法从杂交一代中筛选得到，即用目的基因的隐性突变纯合体与具高度活性转座子的纯合体杂交，极大多数的F1个体为正常表型，但其中会有极少量的表现隐性性状的转座子插入突变体。正向基因标签和克隆法在利用异源和低拷贝数品系时尤其有用。

采用反向PCR或热不对称交替PCR（TAIL-PCR）很容易从单拷贝或低拷贝数品系中获得插入子两侧的基因组序列。TAIL-PCR由三轮连续的半巢式PCR组成，所用引物为三个巢式插入子特异性引物和一个可与插入子两侧序列退火结合的随机小引物。

内源转座子标签基因的克隆常较为复杂，因为基因组中通常有许多相关的转座子。除非可用转座子特异性的内源探针鉴定出诱发突变的转座子，否则，Southern分析所用琼脂糖凝胶的分辨率将严重制约插入子的鉴定。而且，随后标签基因的分离、克隆也同样耗时费力，需要进行插入突变体基因组文库的构建和筛选。这就是采用Ac转座子克隆出玉米的bronze基因后，利用内源转座子仅克隆出少数植物基因的原因所在。最近，几种新设计的PCR法克服了其中的一些难题。例如，用反向PCR从突变体和野生型中扩增出矮牵牛内源转座子的dTphl的两侧序列后，结合差别筛选，克隆了几个为（dTphl所标签的基因。转座子显示和插入诱变位点扩增（AIMS）都是以扩增片段长度多态性（AFLP）为基础的新技术，利用它们可从多拷贝品系中分离出转座子两侧的基因组序列。这两种方法的共同点是：基因组DNA用两种酶酶切后，酶切片段两端都连上一个接头。用于酶切的酶，一个识别位于插入子中的保守位点，另一个切割位于附近的转座子两侧的基因组序列。其区别是：转座子H示法的第一轮扩增产物是用根据接头和转座子序列设计的嵌合引物及另一个接头上的引物扩增得到；AIMS的第一轮扩增产物是用一个生物素标记的转座子特异性引物线性扩增得到。但它们的第二轮扩增产物都是用一个经同位素标记的、转座子特异性的巢式引物和另一个接头上的引物扩増第一轮产物得到的。然后用聚丙烯酰胺凝胶分离所得到的转座子两侧基因组序列，并进行放射自显影。从凝胶上分离出与突变表型共分离的两侧序列后，经扩增测序，用于cDNA或基因组文库的筛选。

转座子显示法和AIMS法的潜在利用价值不仅仅局限于基因分离。其高分辨率和灵敏度使详细地同步分析由一百个以上密切相关转座子组成的转基因簇的插入特性成为可能。

反向遗传学

反向遗传学旨在通过创造和分析“敲除"突变体表型，确定已知序列的基因功能。

基因失活是获得“敲除"突变体的有效方法。利用这种方法，可分析许多由基因组测序项目确定的或存在于表达序列标签（EST）数据库中、尚未研究的开放阅读框（ORFs）的生物学功能。目前，已建立了多种“敲除”基因和简化基因失活个体鉴定步骤的方法。

插入诱变法和通过同源重组的基因失活和基因替换法正用于酵母的大规模诱变研究中。用酵母内源转座子Ty1的随机转座法及用Tn3（带有lacZ基因，用于基因调控）诱变E. Coli中的酵母文库，然后通过同源重组用突变酵母序列替换相应的酵母内源基因的方法，已创造了大量标签突变体。

另一种产生诱变群体的方法是用一段由一个独特的20 bp标签和一个为卡那霉素标记组成的合成片段，系统地依次替换酵母的6000个ORFs。虽然从技术角度讲，植物也能进行这样的同源重组，但其频率很低，尚不适用于大规模的功能分析。

对植物而言，转座子和T-DNA插入诱变显然是开展大规模功能基因组研究的最佳方法。这两种方法均可用于创建饱和标签群体，并可用插入DNA作为标签来鉴定相应的标签基因。

用于反向遗传学的基因标签系统

将插入诱变应用于反向遗传学是植物标签技术的最新进展。

以前，用内源或异源转座子已创建了用F2进行突变体筛选的转座子标签群体，同时，增强子俘获型（Enhancer trap）和基因俘获型（Gene trap）品系也已被用于鉴定启动子和具有特定表达模式的基因。虽然，利用上述方法创建的群体可用于反向遗传学筛选，但应该强调的是没有一种应用标签技术是特地为反向遗传学技术进行大规模基因功能分析而设计的。因而，所有方法都有其不足之处，从而影响“敲除”突变体的鉴定效率及其表型分析。一个高效反向遗传学体系的前提是应该能准确地确定是否真正获得了所需的“敲除”突变体。这一点显得尤其重要，因为，大多数基因的“敲除”突变体可能并没有易于鉴别的表型。

以下将举例说明不同的标签法，这些方法目前都应用于反向遗传学研究。

内源标签体系

利用内源多拷贝数转座子，如玉米的施因子和矮牵牛的，已建立了用于插入突变体筛选的反向遗传学方法。此方法的优点是：

1.易于获得和保持插入突变大群体；

2.利用多个内源因子发生转座的品系，在小群体中就足以确保发现每个基因的标签突变体。

其不足之处是：

1.虽然许多像Mu这样的内源转座子具有明显的插入到基因中去的倾向，但它既插入到编码区，也插入到非编码区中；

2.群体中只有一小部分插入系是真正的基因“敲除”突变体；

3.“敲除”突变体的鉴定效率完全取决于鉴定插入位点是否为真正基因“敲除”的方法的能力。

在多拷贝品系中，群体中的每一个个体都可能同时拥有多个由转座子诱发的基因“敲除’’突变。因而，表型与插入子间的遗传连锁关系不但要用多拷贝，而且要用低拷贝品系才能确定，然而，这种评价因多拷贝品系的异质性变得十分复杂，尤其是对那些敏感的表型，往往需要几代杂交才能消除与插入因子无关的背景。

工程化标签体系

建立一个具工程化转座子插入突变的大群体是一项十分艰巨的工作，而且，随后插入位点的鉴定及其突变体的表型分析也同样需要付出巨大的努力。因而，充分利用工程化体系的优点十分重要。转座频率、转座时间、转座子切离和再次插入的调控方法以及使插入位点随机地分布于整个基因组的技术以前已有评述。

基因俘获型载体已被应用于哺乳动物、果蝇和植物中。这种载体（基于T-DNA和转座子）中的标记基因表达与否，取决于载体的插入位置，因而根据标记基因的表达情况可以筛选出转座子转座到基因中去的插入系，实现基因俘获。

标记基因的特异性表达可通过几种途径实现。第一种选择是在标签载体中设计一个无启动子的标记基因，当标签载体插入到活性内源植物启动子下游时，这个标记基因就能得以表达。在植物中，至今已设计了多种基于T-DNA和转座子，以无启动子的uidA报告基因作为标签标记的载体。

严格地说，这种标签载体只能用于检测转座子位于功能启动子下游的插入子。如果标签载体中标记的表达不仅仅决定于内源启动子的活性，同时也决定于转录加工（剪接）和翻译融合，那么就可以更严谨地筛选基因插入事件。在基于Ds的载体中，在其W报告基因前导入一个内含子和剪接接受位点就可以实现以上目的。因为含有基因的转录产物需要剪去内含子，这样，编码序列与内源基因序列相结合就可以产生P-GUS活性。

这种基因俘获型体系的一个显著优点是：可通过植物发育过程中GUS染色模式的分析详细研究标签基因的表达模式。这种有关表达模式方面的详细资料对随后纯合插入突变体的表型分析很有用。其不足之处是：它既不能剔除基因外的插入子，也不能排除uM报告基因与标签基因转录方向相反的插入子。

早在1989年，Koncz等就提出了利用无启动子标记的思路，使选择标记只有在与T-DNA端部附近的具表达能力的内源基因形成转录或翻译水平的融合后才能表达。但当时认为这种想法不尽人意。含无启动子的抗卡那霉素选择标记aph （3'）Ⅱ的T-DNA载体曾被用于转基因研究，然而，对卡那霉素的选择往往倾向于选择出aph （3'）Ⅱ高水平表达的愈伤组织，以及在选择过程中整合到高度表达基因中去的T-DNA和多拷贝T-DNA整合体。如果在T-DNA中设计一个潮霉素（hyg）抗性基因作为转基因的初次选择标记，而aph （3'）Ⅱ仅作为次级报告基因，就可以克服这些问题。

上面举例说明了植物中应用的基因俘获体系，它是用于选择而不是用于筛选的。这种体系有两个重要缺陷：一是不能充分利用GUS启动子或基因俘获型体系在基因表达分析方面的优点；二是根据无启动子抗性基因表达情况进行的标签个体的分离取决于标签基因的表达状态。

在前面的例子中，基因俘获型载体中标记基因的表达取决于内源启动子的活性，如果使标记基因的表达取决于特有mRNA的合成和终止，那么还可以选择或筛选出不取决于内源启动子活性的基因特异性插入子。这两种选择法目前都已应用于老鼠胚性干细胞的高效诱变基因俘获体系中。所用反病毒基因俘获载体含有两个重要构件。其中在表达分析构件的选择性标记（β半聚糖苷酶-nptII融合基因）和多聚A信号前有一个剪接受体和一个内部核酶进入位点，这一表达分析构件用于标签基因表达特征的详细分析。在选择构件中含有一个嘌呤霉素抗性基因，其表达由反病毒构件中的组成性启动子控制。嘌呤霉素抗性基因没有多聚A序列，并终止于保守的剪接供体位点。当剪接供体位点与其下游内源外显子的剪接受体相组合时或由宿主基因组提供多聚A位点（即转座子已插入到基因中）时，嘌呤霉素抗性得以表达。

将此方法应用于植物可显著减少所需产生和分析的品系数，同时也不牺牲由表达分析装置所提供的优点。

上面所描述的工程化基因俘获体系还含有报告基因和选择基因，当它们插入到某个基因中后，就能得以表达。为防止在分离所需插入突变的同时分离出非目的基因特异性的插入突变，以及为了排除所获得的表达模式是几个标签基因表达模式总和的可能性，有必要将这些方法局限于单拷贝插入文库中。

确定插入位点：随机测序法与位点选择性法

前面我们举例说明了几种用于创建反向遗传学应用插入突变大群体的基因标签体系。对这些诱变群体中标签基因的鉴定方法主要有两种：一是随机扩增和测定插入子两侧的序列；二是特异性地筛选目的基因中的插入子。单、多拷贝数品系都已有相应的标签位点筛选法。

插入子的两侧序列可用反向PCR、转座子展示、AIMS、TAIL-PCR及其有关的技术扩增基因组DNA得到。另外，插入子的两侧序列也可用5'或3'cD-NA末端快速扩增法，从cDNA的第一链扩增得到（RACE）。单拷贝品系插入子的两侧序列，可直接用于测序，对多拷贝品系，可先用测序胶分离从不同插入位点扩增得到的产物，回收纯化后，进行再扩増，然后逐个测序。

为筛选特定基因中的插入子，一种最早用于P因子插入位点特异性选择的、以PCR为基础的方法已被应用到标签体系和不同模式植物中，如矮牵牛、拟南芥和玉米。这种方法的原理是用一组基因特异性和插入序列特异性的引物，经PCR扩增来鉴定插入于某个基因中的已知因子。PCR技术的敏感性，尤其是将PCR产物与基因特异性探针杂交后，可容易地从成百上千个个体的群体中检测出某个特定基因中的插入子。当样品很多时，将所需筛选的样品三维地或金字塔型地进行组织，可大大鉴定减轻标签个体的工作量。

随机测序法或位点选择性筛选法，哪一种更适用取决于：

 · 标签体系；

 · 模式植物的全基因组序列是否已知；

 · 突变体的鉴定速度。

插入标签的系统测序无疑可创建含大量转座子两侧序列的数据库，如果全基因组序列已知的话，通过序列比较就可容易地鉴定出标签的基因。如果插入突变体的基因组序列尚求知，采用特异性PCR筛选法将更快，且更有利于发现突变体。例如特定条件下差异性表达的一组基因，或基因簇的各个成员基因。然而，为满足大规模功能基因组分析的需要和与随机测序相竞争，还需研制可同时筛选多个不同基因中插入子的PCR新方法。

展 望

用基因俘获和报告基因系分析法，或用微列分析法研究整个基因组的表达特征，可揭示同一过程中所包含的所有基因的联合表达模式。如果已知全基因组序列，比较在同一组织、发育阶段或特殊条件下表达的基因上游区域，可鉴定出控制这种表达特异性的共同特征序列。目前，处理这种问题的代数方法已被应用于鉴定酵母集中表达基因的启动子。对表达特征进行分类后，就可以更直接地研究与某些途径有关基因的遗传及其分子互作。

通过“敲除”突变体的表型研究，可为基因的生物学功能提供强有力的证据。许多不同真核生物单基因敲除试验的结果表明，基因功能存在高水平的冗余性。虽然我们应该注意到非同源基因之间也可能存在功能冗余性问题，但一旦鉴定出某个基因簇中各个成员基因的“敲除”突变体，就可以系统地研究基因的冗余性问题。然而，很多基因的功能即使用“敲除”突变体的表型分析也不能加以揭示，因为，实验室条件有时并不适用于分析某些基因功能。一个很好的例子是用反向遗传学方法从拟南芥中筛选出来的根部特异性IC通道蛋白AKT-l基因的T-DNA插入突变体。在几种不同的营养培养基上，akt-l纯合体并不表现出明显的突变表型，但是，在NH₄⁺存在条件下，低浓度K⁺离子显著地抑制akt-l突变体的生长。另一项分析揭示了其敏感性。ad2-l，act4-l和act7-lX的T-DNA标签纯合突变体也均没有明显的突变表型，但是，用这些等位基因发生分离的群体所进行的多代分析结果表明，这些基因的频率随分离世代的增加而降低。这说明这些突变体有降低植物适应性的作用。

在酵母中，多种方法已被应用于鉴定对不同生长条件表现抗性或敏感性的基因。例如，有一个酵母基因缺失突变体大群体，其中的每一个基因（6000个）分别被一个卡那霉素抗性基因和一个独特的20 bP标签所替代，这些突变体能在对大多数细胞有毒的培养基上生长，因而，存活株系中的基因“敲除”突变体可用其独特的20 bP标签，与一块按特定方式排列有所有不同的20 bp标签的微队列分析芯片进行杂交的方法鉴定出来。在另一种称做基因组指纹的方法中，用位点专一性PCR法筛选一个Ty转座子饱和插入群体中的每一个插入突变体，由于其中的一个引物是基因特异性的，因而可根据其各具特点的基因组指纹的PCR产物（转座子两侧序列）来鉴定各种基因“敲除”突变体。

这些方法是根据酵母基因组小，繁殖周期短、细胞的生长条件易于控制和有些株系具有单倍体扩増能力的特点而设计的。

虽然有几种表型筛选法（多数是用F2代）也适用于植物插入突变大群体的选择，但要将这些植物突变体像酵母那样进行大规模的抗性和依赖性筛选是不切实际的。

植物功能基因组分析的不同领域正在逐步汇合而形成一种强有力的分析工具。如果基因组测序项目所得的序列与某个功能已知基因的序列存在同源性，这就为确定该基因的功能提供了重要线索。用DNA微队列杂交分析法、代表性差异分析法、差异显示法和cDNA的AFLP分析法进行的基因表达分析可用于鉴定某些特定过程中的基因。最后，可将测序和表达分析的结果综合起来，为从大规模插入诱变项目中得到的“敲除”突变体设计新的表型分析方法，以揭示目的基因的功能。

反向遗传学在功能基因组分析时代中的极大潜力可能表明正向遗传学的时代行将结束。但事实并非如此，对用反向遗传学方法获得的插入突变体进行分类，可显著地增加定向转座子标签和图位克隆法的效率。如果突变基因是根据表型进行鉴定的，那么突变基因定位是克隆该基因的先决条件。在定向标签中，转座子可作为局部诱变的出发点。如果我们已知某植物的基因组序列和插入突变体的类别，那么在初略地对突变基因进行定位后，与此突变基因紧密连锁的标记可能可以确定一段包含上百个基因的DNA，通过这些基因序列可以说明在这个区域中哪个基因对突变体的影响最大。从分类的插入突变体文库中，找出与这些基因相对应的“敲除”突变体后，就可以用纯合体来分析“敲除”突变体的表型，或将插入突变体与已经定位的突变体一起用于等位性测验。由于正向和反向遗传学法都是插入诱变的分枝方法，这两种方法之间其实没有实质性的区别。唯一的差异在于是先确定插入位点，还是先确定表现型。

 ［Trends in Plant Sciences，1999年4月3日］