本篇报道围绕2022年度上海市自然科学奖一等奖项目“非人灵长类模式动物构建”展开。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心研究员孙强领衔完成。
中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心非人灵长类研究平台研究员孙强
“拔一根毫毛，吹出猴万个！”《西游记》小说中的这一情节生动地展示了什么是“克隆”。
克隆，可以通俗地被理解成“拷贝”，“像是复印出来”一个或一个个完全相同的个体、单元。
而这与“龙生九子”截然不同：克隆，跳过了两性生殖过程，也跳过了前者可能发生的遗传物质的组合或变异。
生命的繁衍，还掌握在上帝，或是神灵手中吗？
2017年，一个世界级成果——全球首例体细胞克隆猴在中国诞生。相关论文于2018年1月25日在国际学术期刊《细胞》（Cell）上在线发表。这一消息当时就激起了整个学术圈和科研界。
此前，全球科学家经过数十年的努力，一直未能攻克非人灵长类动物体细胞克隆的难题。直到两只体细胞克隆猴“中中”“华华”诞生。
对这一技术的攻克，意味着人类可以借助克隆猴技术，揭开更多生命科学的奥秘，比如灵长类的发育、大脑以及多种疾病相关难题。但即便到了今天，体细胞克隆猴技术依然存在瓶颈，成功率依然不高。
“我们做克隆的目标是为了更好地构建非人灵长类模式动物。”孙强说。
为什么需要克隆猴？
在克隆猴诞生前，猴子也被用于转基因或药物测试等研究。这些猴子都是由受精卵发育来的。
“但它有一个问题，就是做出来基因型是不同的，每只猴子之间的遗传背景也不同。”孙强表示，“再举个例子，比如说用考试去筛选一群学生，我们要给这些学生同样的考卷，对不对？我们筛药也是一样的，你这个待‘考试’的药物好不好，你得用同样的试卷，这样才能减少样本间的误差。否则100个人参加考试，有100张不同的考卷，你怎么评价谁的水平高，谁的水平低？考卷就是这些‘猴子’，做考卷的就是这些药。这些猴模型，比如说基因编辑和转基因的，它们的基因型不同，致病基因可能表达水平就有差异，遗传背景也会产生影响，那么就把要研究的问题复杂化了。克隆技术正好可以解决这一难题，让它们遗传背景一致，基因型一致。这样就能够让它真正变成模式动物。所谓模式？就是用一个模子刻出来的。”
克隆猴提供了几乎完美的模型。猴是灵长类，是生命演化中最接近人的动物。
“比如，如果我有一批A基因突变的猴子，其他所有背景都一样，只是A基因有差异，如果跟对照相比，一个药物能够缓解A基因突变导致的症状，那么就可以确认这个药是对的。”孙强说。
除了测试药物，威力更强大的是，基于这一几乎完美的动物模型，人们可以进行新药物的研发，以及探索生命科学的未知疆域。
其实，“克隆”无处不在。植物的无性繁殖，比如插条、嫁接、落叶生根等，都是“克隆”。人类也在很早就开始尝试克隆各种动物。但非人灵长类动物，比如猴子的克隆，始终是个难题。
早在20世纪初，德国动物学家、实验胚胎学先驱汉斯 · 斯佩曼（Hans Spemann）已经使用胚胎分裂技术克隆出了蝾螈。
胚胎分裂技术作为早期探索阶段的技术，当然是不完美的，它的效率很低，因而没有成为动物克隆领域研究的主要方向。孙强表示：“你可能在二细胞期或四细胞期分离，你最多也就分离出4个细胞。假如全部都变成个体，最多也就变成4个个体。但实际上，四细胞期有时候也就出生存活一个或者两个，所以说目前胚胎级克隆的克隆数有限。而体细胞克隆，理论上是无限的。”
所以现代的动物克隆技术的主流是“核移植”——给卵母细胞（卵细胞）换一个细胞核。同样因为胚胎细胞在数量上的局限性，其中翘楚还是体细胞的核移植。一个细胞核，对应着克隆后代的一个小生命。
1928年，斯佩曼尝试将蝾螈胚胎细胞核转移到卵细胞中，虽然最终没有克隆成功，却是“移核”的首次实践。
1962年，英国牛津大学的科学家约翰 · 戈登（John Gurdon）将非洲爪蟾肠上皮细胞的细胞核移植到蛙卵细胞里，并培养出蝌蚪。其实验成功率只有2%。
1996年，克隆羊多利诞生。277次核移植，只产生29个胚胎，最后有且只有多利幸运地出生了，这个成功率比非洲爪蟾的2%还低。但多利的诞生，打破了“体细胞无法分化”的成见。
随后，猪、牛、狗等动物的体细胞核移植克隆都被实现。但克隆猴一直“胎死腹中”。
克隆猴不仅仅是为了克隆猴。克隆猴诞生之初，研究团队负责人蒲慕明院士和孙强研究员说，制备克隆猴不是为了猎奇，更不是为了克隆人，而是为了建立非人灵长类疾病动物模型，为研究人类疾病机制和药物研发带来希望。
愚公“移核”与克隆猴的瓶颈
在体外人工构建一个生命体，何其难？生命的繁衍过程太复杂了。
“挑战太多了！”孙强说，“不用说培养一只猴子，就是从胚胎，不依赖任何母体，直接培养出一只老鼠，那都是非常震撼的事情，意味着（哺乳动物）生命可以在体外培育了，那是真正的试管了。”
他表示，目前，早期胚胎的所有发育还没完全搞清楚，子宫是怎么保证胎儿营养的，器官在子宫内是怎么分化的，什么诱导了器官的对称发育……没有回答的问题太多了。“离开子宫还做不到，你怎么模拟一个子宫的环境？早产儿，毕竟在母体里待到250天或者更长时间，接近出生，各个器官都发育完成了，但是要真正变成从一个受精卵一个细胞开始完全培养、发育长出来很难。如果那个能做出来，远比克隆要震撼得多！”
所以，现在要克隆猴，还是要“借腹”：依靠卵母细胞，以及其他没有提供卵母细胞的雌猴“代孕”。
构建一个重组细胞，激活，移植到代孕雌猴子宫内，然后待产。
孙强介绍，2003年，美国匹兹堡大学的杰瑞 · 沙腾（Gerald Schatten）教授依靠美国俄勒冈灵长类中心，曾经一次性做了700多枚卵，然后移植到30多只猴子体内，最后都没成功，他当时很失望。俄勒冈灵长类中心的另一位教授——舒克拉特 · 米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）觉得这可能是技术问题。2007年，他接受一个杂志的采访，说他已经用了1.5万枚卵来做这只猴子。到2010年的时候，他发了一篇论文，就是把克隆胚胎移到10只猴子体内，但是只有1只怀孕，而且怀孕到81天，这只猴子就流产了。
“我们总共用了接近5年时间去解决这些问题，前边都是失败，最大的失败出现在2017年的8月。”“8月的时候，我们就得到了两只克隆猴，一只在140多天的时候生出来，活了3个小时，没有肺呼吸，死掉了；另一只活了30个小时也死掉了。那个时候我们的失望达到了极点，就像买彩票，彩票中奖号码是10个，第1个号码到第9个号码都是对的，然后到第10个号码突然错了。”
从失败中走出来，2017年年底，他们终于成功做出了克隆猴。
孙强介绍：“实际上，体细胞很小。猴子的卵母细胞直径110微米，很大，体细胞直径大概就十几个微米。我们没有取核，它带的细胞器和线粒体也很少。我们是直接把整个体细胞融合进去了。我们检测过，华华细胞中来自供体体细胞的线粒体接近20%，中中的大约不到3%。”
“现在的问题是，克隆的效率还是很低的。猴子体细胞的表观重建的机制，以及早期胚胎的表观遗传学变化还不清楚。我觉得，最主要的，也是首先要做的，是把猴子的表观遗传学机制解析清楚，在此基础上，真正提升体细胞克隆的效率——希望能把现在大概3%左右的水平，提升到10%或以上。”
孙强说：“在2024年年初，我们发了一篇文章，在克隆恒河猴时，我们解决了胎盘的发育问题，通过滋养层细胞置换，把重构效率从2%提升到9%左右，提升了4倍多。”
孙强表示，克隆不是一个自然发育的过程，要打破很多障碍。通过这个克隆过程，人们可以了解胚胎早期发育，尤其表观遗传学层面的生物学机制，这也是对生命的认识。
目前，孙强团队正在用多组学和测序的方法来分析细胞基础表观的变化是什么样的、克隆时什么样，来观察各种调控过程的振荡。
科研三阶段：试管猴、转基因猴、克隆猴……
“有人跟我联系，说他养的宠物狗不行了，能不能把它克隆出来。这太简单了，国内有公司在做。我做的是克隆猴。”孙强说。
在一次演讲中，孙强提到他研究历程中的三个阶段：试管猴、转基因猴、克隆猴……
他说，在云南省的西双版纳州澜沧江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。
那是一个973国家重点研发项目，他接手的时候，项目已经执行了一半。因为2001年转基因猴技术体系已经建立了，所以项目的目标是希望做出转基因猴。他是半途去的，目标是至少要做出试管猴，如果能做出转基因猴更好。
他记得非常清楚，2007年立春的2月4日当天，他们就做出了中国第一只试管猴，之后又做了十几只猴子，但是很遗憾，没有一只是转基因阳性的。项目结束以后，由于没有资金的支持，他从山上撤回来了。
回来以后，在上海待了半年多。很幸运，一个机会出现了。中国科学院神经科学研究所（简称神经所）的蒲慕明先生找到他，让他继续研究猴子。
这次是苏州太湖的西山岛，上面有一个很大的猴场，1万多只猴子，他就到岛上去陪猴子了。
在孙强的讲述里，工作人员要做的一件事情是要看猴子的月经。岛上实验室大概有1000多只猴子，每年看猴子的月经累计要看5万多次。每次猴子“超排卵”都要打针，从月经来的第一天开始，一般要打12天，一天打2针。
孙强介绍，小白鼠连续20代近交，得到近交系，即遗传背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，连续20代也就顶多10年时间，这件事在20世纪初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟时间、传代时间要5年，做20代就要100年，“没人能做得成”。这就是人们为什么需要克隆猴——等不起这100年。
在世界首个体细胞克隆猴成果新闻发布会的报告中，孙强表示，体细胞克隆总结下来有4个节点：构建胚胎、激活胚胎、启动核基因组、着床后发育。除了最后一个节点无法控制，前3个节点都可以干预。只不过，每一个节点都是一座“大山”。
起初，团队里其他成员都是兽医，包括取卵在内的大部分精密实验操作都由孙强一人承担，即使在2010年国庆假期，孙强在雨夜骑车出车祸、锁骨骨折，他也忍着剧痛花十天做完原定的取卵实验才住院手术。绝大多数时候，大多数目标都不值得以健康为代价的投入，但在该项卓绝的研究面前，孙强认为他必须这么做。幸运的是，研究生刘真在同一年加入孙强带领的灵长类研究平台，次年（2011年）开始岛上的生活，很快成为团队的骨干，分担了压力。
刘真花了两年练习并优化构建胚胎的流程，“刚开始是在小鼠卵母细胞上练习，差不多连续三四个月每天练习8到10个小时”。后来转到了更难的猴细胞上精进磨练，眼睛看着显微镜，两只手操作，脚也要同时操纵任务。“生物不同于物理和数学，既要动脑，也要动手。”说起当时选择生物技术作为大学专业的原因，刘真这么回答。但他当时应该没想过，在未来还要动脚。手脚并用地练到了2014年底，刘真的实验操作炉火纯青，去一个核平均只要10秒，而注入核同样用时甚短。
孙强主任说：“我们的团队成员可以做到15秒内实现体细胞注入操作，只有精湛的技术才可以保证对卵母细胞损伤最小；另外体外时间越短，损伤也越小。”刘真博士不是团队唯一一个如此付出、如此熟练的人，后来神经所有一支能熟练操作细胞核移植的队伍。
体细胞克隆的研究就是这样，大部分时间都在漫长的等待和重复的实验中度过。重复的实验不仅是一种体力活。刘真说：“其实并不是大家理解的，你每天坐在那儿苦练就行，更重要的是，要在这过程中不断调试和寻找更好的技术方法和流程。”而突破的实现，靠的就是在每一个环节试错，在每个动作细节中抠出百分之几的改进空间，累积而成。
为了提高激活胚胎的成功率，团队尝试了多种激活条件，一开始使用只有13%囊胚率的离子霉素+6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）。后来使用组蛋白乙酰化酶抑制剂处理，囊胚率提高到16%。效仿2014年一篇文章的条件，用组蛋白3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）去甲基化酶（Kdm4）处理后，囊胚率升到45%。
团队还尝试了不同的体细胞，因为不同来源的细胞成功率不同。最后他们发现成纤维细胞是最好的选择，也正是用成纤维细胞核，克隆出了中中和华华。
孙强表示，他觉得克隆猴“中中”“华华”只是个新起点，他希望在这个基础上能做更好的模式动物。“追求真理，保持好奇心。我还要感谢一下我的家人，因为这些年跟猴子在一起的时间，比跟他们在一起的时间都多。”
